Arne Røseth.
Clostridium difficile-infeksjon (CDI) er et økende problem i klinikken og behovet for rask og enkel diagnostikk er skrikende.
I Storbritannia er det i dag obligatorisk å teste alle pasienter eldre enn 2 år som har diaré for CDI. Kostnadene ved dette er betydlige, og særlig hos pasienter med kronisk tilbakevendende CDI.
Det er en myte at CDI kun oppstår i sykehusmiljøer og hos pasienter som har vært behandlet med antibiotika; det er for eksempel svært vanlig hos onkologiske pasienter og ikke minst hos sykehjemspasienter. Sistnevnte grupper er godt representert på indremedisinske avdelinger, og det er derfor viktig at pasienter fra «høyendemiske» miljøer screenes for CDI før de kommer på post hvor smitten kan være svært vanskelig å få bukt med.
Jeg vil gi en liten historisk oversikt over hvordan utviklingen av testprosedyrer for CDI har utviklet seg de senere årene. Utviklingen har gått fort, slik at det kan være vanskelig å få oversikt over hva som var comme-il-faut for 2–3 år siden og hva som anbefales i dag.
Den første virkelig brukbare testen på CDI var Bartels «Cell culture cytotoxicity neutralization assay» (CCNA) som kom på markedet i 1978 og tok utgangspunkt i tilstedeværelse av CD-toksin i avføringen. Man tok frosset avføring som først ble tint, deretter fortynnet, så vortekset før centrifugering. Et par ml av supernatanten ble deretter filtrert gjennom et 0.45-μm filter. Filtratet ble deretter applisert i microtiterplater sammen med en human fibroblastkultur og inkubert ved 35–37°C. Etter 24–48 timer så man etter morfologiske endringer i disse cellene med et invertert mikroskop. Denne testen viste seg å ha stor variasjon da det ikke var gode kriterier for cytotoksisitet. Dette var lenge betraktet som «gullstandarden» for CDI inntil man fikk neste generasjon CDI-test. (1)
Også her tok man utgangspunkt i frosset avføring. Etter opptining ble fecesprøver inokulert på cycloserine-cefoxitin-fructose-agarskåler sammen med hesteblod og inkubert anaerobt ved 35–37°C i 48–72 timer. Hvis det ble observert oppvekst av C. difficile; grå-hvite kolonier med opphøyet sentrum og med hårete kanter som luktet «hestemøkk» og samtidig fluoriserte ved eksponering for UV-lys, var dette indikasjon på CDI. Hvis gramfarging var forenlig av Clostridium difficile, ble koloniene sådd ut på en hjerne-hjerte-agar og etter ytterligere 2–3 døgn ble de testet for CD-toksin A&B og/eller glutamat dehydrogenase (GDH). (1)
Dette ble etterhvert den nye «gullstandarden» men som sikkert leseren nå har fått et inntrykk av, så var det fortsatt gode muligheter til forbedring…
Disse kom på markedet i 1984 og ble raskt populære da dette var en forholdsvis enkel og rask metode. De første testene var ELISA-tester; microtiterplater ble belagt med antistoffer mot toksin A/B. Fecesekstrakter ble deretter applisert og inkubert før brønnene ble vasket. Deretter ble et nytt enzymkonjugert antistoff applisert. Etter ytterligere en inkubasjon og vask la man på substratet som reagerte med enzymet, og leste av fargeforandringen som indikerte positiv prøve. Dette var klart mye enklere enn de to ovenfor beskrevne tester, men det viste seg at toksin A/B-tester manglet sensitivtet på grunn av lave verdier av toksiner i feces.
Det kom ettehvert lignende tester basert på «Lateral Flow»-prinsippet, dvs. en teknologi tilsvarende den som brukes i graviditetstester. Fordelen med toksin A/B-tester er at svaret kommer etter ca 15 min, men sensitiviteten er enda lavere enn ved ELISA (2)
Dette membranbundne proteinet er felles for alle Clostridier og er tilstede i mye høyere konsentrasjoner enn toksin A/B, defor har GDH-testen mye bedre sensitivitet enn toksin A/B, men ulempen er at spesifisiteten er vesentlig lavere enn ved toksintestene. GDH-testen er også enten ELISA- eller lateral flow-basert som beskrevet ovenfor. Metaanalyser som kom i 2010–11 antyder en sensitivitet på omkring 85–95 %, men pga. lav spesifisitet anbefaler man å benytte GDH-testen som en screening for deretter å gjøre mer spesifikk testing som CCNA eller dyrkning.2
Først ute var «real time PCR»-baserte tester (PCR = Polymerase Chain Reaction). Her blir først DNA fra feces ekstrahert og amplifisert via PCR-teknikk. Deretter tilsettes kjente prober som følger med kittet til det ekstraherte f-DNA. Etter en rask inkubering påvises hybridisert DNA som påviser DNA fra toksin B som tegn på positiv prøve. Ulempen med denne metoden er at den er svært kostbar; den krever spesialkompetanse, kostbart utstyr og instrumentering som såkalte «thermocyclere» samt avanserte laboratoriefasiliteter for å unngå kontaminasjon og kunne oppnå pålitelige svar. (3)
Det er i den senere tid kommet 2. generasjons molekylærbaserte tester som benytter lukkede kassettsystemer med enkle forbehandlingsprosedyrer og automatisert instrumentering basert på et «sample-in result-out»-prinsipp. Noen av disse testsystemene er basert på isoterme DNA-amplifikasjonsteknologier Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) eller Helicase Dependent Amplification (HDA) som benytter seg av velprøvde signalgenereringsteknologier, noe som også er med på å redusere instrumenteringskostnadene. I tillegg er såkalte blokkerte primere tatt i bruk i et HDA-amplifikasjonssystem (Blocked Primer HDA, bpHDA). Primerne er her blokkert for mangfoldiggjøring inntil de deblokkeres av varmetolerante enzymer ved riktig amplifiseringstemperatur. Dette forhindrer dannelse av primerartefakter og forkorter prosesstiden.
Om dette ble mange og kompliserte ord og uttrykk, så er kortversjonen at molekylærdiagnostiske tester har blitt svært forenklet uten at dette har gått på bekostning av kvaliteten. Slike teknologiske nyvinninger er med på å muliggjøre pasientnær testing som kan utføres av spesialtrente sykepleiere i enkle laboratoriefasiliteter som for eksempel på en sykehuspost eller i mottagelsen. Prøvetaking og ekstraksjon av fecesprøven gjøres i løpet av få minutter i enkle lukkede rør som gir minimal eksposisjon av feces overfor helsearbeidere. Jeg ser for meg at slike testformater kan bli svært viktige i «triage» av for eksempel diaré pasienter.
Testene er også blitt vesentlig rimeligere enn PCR, og nye lukkede systemer gjør at de gir grunnlag for enklere og mer pålitelige diagnostiske algoritmer enn tidligere, noe som i sin tur medvirker til raskere behandling og kostnadsbesparelser for helsevesenet. Vi vet at isolering av pasienter er svært dyrt. Derfor er det viktig å utelukke alvorlige smittsomme sykdommer på et tidlig tidspunkt. (4)
I henhold til European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) bør alle pasienter som har vært innlagt i sykehus og som utvikler diaré, screenes for C. diff. (5)
ESCMID anbefaler at det først screenes for GDH, positive prøver blir deretter testet med molekylærbiologiske teknikker eller toksinprøver. Jeg vil imidlertid minne om at disse «guidelines» stammer fra 2009 og at det har rent mye vann i havet siden den gang. De fleste er i alle fall enige om at toksintester er «utgått på dato» pga. for dårlig sensitivitet og bør erstattes av molekylærdiagnostiske metoder. Dette ble også poengtert av Dr Thomas LaMont på fjellmøtet noen uker siden.
Som ”IBD-olog” mener jeg at alle IBD-pasienter hvor det er mistanke om residiv skal testes med molekylærdiagnostiske tester. Grunnen til dette er at hos disse pasientene kan en falsk negativ test få store konsekvenser – som sikkert de fleste av oss har erfart. Tar vi feil her og tror at den aktuelle situasjonen skyldes et tilbakefall av grunnsykdommen og gir imunosuppresiv, steroider og lignende behandling eller i verste fall biologisk behandling, så er veien til kirurgen ubehagelig kort. Studier viser betydelig større risiko for kolektomi hos UC pasienter som får CDI. Det er derfor svært viktig at denne differensialdiagnosen ikke feilvurderes.
Opplysning: Forfatteren oppgir at han er gift med Mona Røseth som er daglig leder i LabTech.
