Bakterieprofil ved nydiagnostiserte tilfeller av Morbus Crohn i Norge

Av: Petr Ricanek, Avdeling for fordøyelsessykdommer, Akershus universitetssykehus
Petr Ricanek

Petr Ricanek.

Årsaken til inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er ukjent, men det er allment akseptert at det foreligger en dysfunksjonell immunrespons, sannsynligvis på bakgrunn av mange faktorer, som innebefatter en genetisk predisposisjon, en ytre påvirkning i form av ukjente miljøfaktorer, og ikke minst bakterier, enten som patogener eller som kommensaler.

Tarmens mikrobiota består av bakterier, virus, sopp og parasitter, hvor bakteriene utgjør majoriteten. Det er anslått at det foreligger 1014 bakterieceller i tarmen, 10 ganger mer enn menneskelige celler i hele kroppen, og at disse representerer 60 % av fæcesvekten. Mer enn 99 % av tarmens mikrobiota tilhører arter fra fire bakterielle fyla; Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes og Proteobacteria. Sannsynligvis foreligger det mellom 500 og 1000 forskjellige arter, men størstedelen tilhører en kjerne av kun 30 til 40 arter. Disse bakteriene er involvert i mange metabolske prosesser, som for eksempel fermentering, høsting av energi fra polysakkarider med produksjon av kortkjedede fettsyrer og gasser. Dessuten er disse mikrobene viktige for produksjon av vitamin K, biotin, aminosyrer og hormoner, og ikke minst for å forhindre kolonisering av patogene bakterier.

Tarmbakteriene antas å ha en nøkkelrolle ved IBD, spesielt Morbus Crohn, og det er derfor viktig å kartlegge og karakterisere den bakterielle sammensetningen i pasientpopulasjoner. Siden forekomsten av IBD synes å variere geografisk og sosioøkonomisk kan sammenligninger av mikrobiota fra forskjellige regioner bidra til å belyse årsakssammenhenger mellom sykdom og mikrobiota. Et sentralt begrep i denne sammenheng er dysbiose, som indikerer en redusert biodiversitet, en redusert mikrobiell stabilitet, lavere nivåer av Firmicutes, samt høyere nivåer av proteobakterier og uvanlige bakterier (1). Samtidig er det observert et økt antall mukosaadherente bakterier i tarmslimhinnen hos IBD-pasienter sammenlignet med tarmslimhinnen til kontroller (2). Det foreligger flere teorier om hvordan tarmbakteriene kan føre til en kronisk aktivering av immunsystemet, som for eksempel en persisterende spesifikk infeksjon, ovennevnte dysbiose, en defekt i den mukosale barrierefunksjonen, en defekt i evnen til å gjenkjenne eller håndtere bakterier, eller rett og slett en immunologisk overreaksjon.

I IBSEN II-studien, en populasjonsbasert prospektiv studie av nyoppdagete tilfeller av IBD, har vi sett nærmere på en del av de potensielle årsakene til sykdommen(e). I et tidligere arbeid kartla vi forekomsten av Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) i tarmslimhinnen hos hele kohorten på 221 voksne og 100 barn (Morbus Crohn, ulcerøs colitt og symptomatiske non-IBD-kontroller) (3). MAP fører til Johne’s sykdom, en granulomatøs tarmbetennelse, som forårsaker avmagring og diaré hos drøvtyggere, som for eksempel geiter, sauer og kyr, og det har vært spekulert i om MAP er en zoonose, som fører til Morbus Crohn hos mennesker.

Ved hjelp av tre metoder (MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), IS900-spesifikk PCR og dyrkning) forsøkte vi å påvise forekomsten av MAP i denne kohorten med nyoppdagete, ikke-behandlede pasienter. Det viste seg at bare 2 av de 75 (3 %) av pasientene med Morbus Crohn hadde et positivt MGIT-vekstsignal og ingen hadde en positiv IS900-spesifikk PCR. I et kontrollmateriale bestående av 33 voksne pasienter (Morbus Crohn, ulcerøs colitt og non-IBD-kontroller) hadde 7 av 7 pasienter med langvarig Morbus Crohn (100 %) et positivt MGIT-vekstsignal og 2 av 7 (29 %) en positiv IS900-spesifikk PCR. I dette arbeidet konkluderte vi med at MAP antagelig ikke er en primær årsak til Morbus Crohn, men at tilstedeværelsen av bakterien snarere er et sekundært fenomen, hvor MAP koloniserer tarmslimhinnen hos relativt immunsupprimerte pasienter med en langvarig diagnose, og muligens kan bidra til sykdomskronisitet i utvalgte pasienter.

Størstedelen av den mikrobielle diversiteten (>80 %) lar seg ikke avdekke ved konvensjonelle dyrkningsmetoder. Ved bruk av metagenomics foretar man en global sekvensering av komplekst genetisk materiale fra (ikke-dyrkede) prøver. Dette kan være prøver fra miljøet, for eksempel jord- eller vannprøver, eller klinisk materiale. Det finnes i øyeblikket to store metagenomicsprosjekter. Hovedmålet til Human Microbiome Project (US) er å kartlegge hvilke mikrober som befinner seg på og i mennesket og lage et referansesett av de genetiske sekvensene fra disse organismene. I Metagenomics of the Human Intestinal Tract (MetaHit) (EU og Kina) ser forskerne på mikrobene i mage-/tarmkanalen med fokus på deres bidrag til overvekt og IBD.

I vår pilotstudie brukte vi metagenomics for å definere de fem til ti hyppigste bakteriene i mukosale biopsier fra terminale ileum og colon descendens. I håp om å komme til så tidlig som mulig i sykdomsforløpet undersøkte vi nydiagnostiserte, ikke-behandlete tilfeller av Morbus Crohn. Vi så på fem individer, fire med forskjellige fenotyper av Morbus Crohn og én non-IBD-kontroll (4).

Etter å ha isolert DNA fra de mukosale biopsiene utførte vi PCR-amplifisering av genet for 16S ribosomalt RNA (rRNA), som er unikt for bakterier. Disse PCR-produktene ble så renset, klonet og sekvensert. DNA-sekvensene ble deretter taksonomisk kartlagt ved hjelp av BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), et verktøy som finner lignende eller identiske sekvenser i en database. 106 forskjellige Operational taxonomic units (OTUs) ble identifisert i DNA-sekvensene fra de fem individene og på bakgrunn av disse ble det laget fylogenetiske trær. Hovedfunnene fra disse trærne er sammenfattet i figur 1.

Figur 1

Figur 1.

Nesten alle identifiserte OTUs tilhørte de to fyla Bacteroidetes og Firmicutes, mens enkelte også sorterte under Proteobacteria, imidlertid bare hos individene med Morbus Crohn. De mest fremtredende slektene var Bacteroides i 100 %, Ruminococcus i 80 %, Faecalibacterium i 70 % og Clostridium i 50 % av biopsiene. Samtlige Proteobacteria, som inkluderte Escherichia coli, Citrobacter freundii og Citrobacter brakii, Pseudomonas frederiksbergensis, Enterobacter hormacheii, Haemophilus parainfluenzae, Sutterella sp. og Parasutterella excrementihominis, ble bare funnet i biopsiene fra pasientene med Morbus Crohn.

Ingen nye spesielle bakterier ble identifisert, heller ikke MAP eller adherent-invasiv E. coli (AIEC), som har blitt assosiert med ileummukosa hos pasienter med Morbus Crohn, viste positiv korrelasjon i denne sammenheng. Imidlertid viser studier fra andre industrialiserte land sammenlignbare observasjoner. Som i studier fra både Canada og USA (5,6) fant vi en lignende fordeling mellom Bacteroidetes og Firmicutes med en økning av Proteobacteria. Bacteroides er antagelig den hyppigst forekommende bakteriearten, både hos friske og syke, og var tilstede i alle biopsier. I likhet med andre studier (7) fant vi også Eubacterium og Ruminococcus. Faecalibacterium ble funnet i syv av ti biopsier, mens Faecalibacterium prausnitzii, som har blitt foreslått å være en anti-inflammatorisk kommensal bakterie, kun var tilstede i to biopsier, én fra pasienten med Morbus Crohn, som hadde lavest klinisk aktivitet, og én fra den antatt friske non-IBD-kontrollen. Citrobacter freundii, en opportunistisk patogen, ble identifisert i DNA fra én av pasientene, mens en annen pasient viste en opphopning av Clostridium rectum i DNA fra biopsier fra både ileum og colon.

I denne studien gjennomførte vi en ”open-ended” metagenomicsanalyse ved å bruke uspesifikke bakterielle 16S rRNA gensekvenser for å avdekke de mest vanlige bakteriene i noen utvalgte norske pasienter med Morbus Crohn. Vi valgte mukosale biopsier fremfor fæcesprøver, fordi det tidligere har vært påvist forskjellig bakteriesammensetning i prøver fra disse to stedene i tarmen (8), og det er naturlig å anta at kommunikasjonen mellom vert og mikrober foregår på grensen mellom mucus og epitel. Vi fant, i likhet med andre forfattere, en god intraindividuell korrelasjon mellom funnene i terminale ileum og colon (9). Det foreligger flere potensielle feilkilder i denne studien, blant annet biopsitaking, lyse av biopsiene, isolering av nukleinsyrene og selve PCR-prosessen. Det kan også tenkes at det er submukosa og ikke mukosa, som er hovedarena for de inflammatoriske forandringene ved IBD, og spesielt Morbus Crohn.

Den bakterielle profilen i våre norske IBD-pasienter ligner på bakterielle profiler fra andre sammenlignbare land som Canada, Tyskland, Spania og USA. Samtidig foreligger det betydelige forskjeller i bakterielle profiler i forskjellige geografiske regioner når man sammenligner land med høy og lav insidens av IBD, som for eksempel Canada og Mexico (10). Fremtidige studier av tarmens mikrobiota bør ta sikte på å se på større grupper av forskjellige populasjoner med forskjellige faktorer, som kan tenkes å påvirke den mukosale barrieren og dens (dys)funksjon. Disse faktorene kan være av biologisk, genetisk, epigenetisk eller geografisk natur.

Referanser

  1. Sokol H, Seksik P. The intestinal microbiota in inflammatory bowel diseases: time to connect with the host. Curr Opin Gastroenterol. 2010;26:327-331.
  2. Swidsinski A, Ladhoff A, Pernthaler A et al. Mucosal flora in inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2002;122:44-54.
  3. Ricanek P, Lothe SM, Szpinda I et al. IBSEN II study group. Paucity of mycobacteria in mucosal bowel biopsies from adults and children with early inflammatory bowel disease. J Crohns Colitis. 2010;4: 561–566.
  4. Ricanek P, Lothe SM, Frye SA et al. Gut bacterial profile in patients newly diagnosed with treatment-naïve Crohn’s disease. Clin Exp Gastroenterol. 2012;5:173-86.
  5. Bibiloni R, Mangold M, Madsen KL et al. The bacteriology of biopsies differs between newly diagnosed, untreated, Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. J Med Microbiol. 2006;55:1141–1149.
  6. Frank DN, St Amand AL, Feldman RA et al. Molecular-phylogenetic characterization of microbial community imbalances in human inflammatory bowel diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:13780–13785.
  7. Hattori M, Taylor TD. The human intestinal microbiome: a new frontier of human biology. DNA Res. 2009;16:1–12.
  8. Zoetendal EG, von WA, Vilpponen-Salmela T et al. Mucosa-associated bacteria in the human gastrointestinal tract are uniformly distributed along the colon and differ from the community recovered from feces. Appl Environ Microbiol. 2002;68:3401–3407.
  9. Wang M, Ahrne S, Jeppsson B, Molin G. Comparison of bacterial diversity along the human intestinal tract by direct cloning and sequencing of 16S rRNA genes. FEMS Microbiol Ecol. 2005;54:219–231.
  10. Bibiloni R, Tandon P, Vargas-Voracka F et al. Differential clustering of bowel biopsy-associated bacterial profiles of specimens collected in Mexico and Canada: what do these profiles represent? J Med Microbiol. 2008;57:111–117.
NGF
Opphavsrett: ©Norsk gastroenterologisk forening
Ansvarlig redaktør: Stephan Brackmann
Webmaster og design: www.webpress.no
Følg oss på: Twitter og Facebook